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    细胞剪切力实验--FOXC2和流体剪切力在后天淋巴管系统形成中的重要作用

    2016-05-16 11:11:17  来源：
    生物体内存在的机械力，比如流体剪切力对内皮细胞有着非常多的影响。在血管中，不规则的乱流通常和血管的疾病（比如，动脉粥样硬化）是相关的，并且能直接影响内皮细胞的分化和凋亡。因此，2015年，瑞士的一个研究小组在淋巴管中研究不规则的剪切力的作用中发现，不规则的剪切力和转录因子FOXC2共同在在淋巴管形成中有着非常关键的作用。在体外培养的淋巴管内皮细胞中，FOXC2受到振荡剪切力的刺激会高表达，并且增强细胞间的联系，降低细胞的增殖率；而FOXC2的失活会使细胞对不规则的剪切力敏感，使细胞连接分解并且促进细胞增值。文中，研究人员选择4dyn/cm2每4秒变换流向的振荡流（OSS，oscillatory shear stress)来模拟体内不规则的乱流。
     
    FOXC2 and fluid shear stress stabilize postnatal lymphatic vasculature
     
    A. Sabine, E. Bovay, C. S. Demir, W. Kimura, M. Jaquet, Y. Agalarov, N. Zangger, J. P. Scallan, W. Graber, E. Gulpinar, B. R. Kwak, T. Mäkinen, I. Martinez-Corral, S. Ortega, M. Delorenzi, F. Kiefer, M. J. Davis, V. Djonov, N. Miura and T. V. Petrova
     
    The Journal of Clinical Investigation, 2015, 10.1172/JCI80454
     
     
    一、实验准备实验材料及设备
    1. 细胞： lymphatic endothelial cells (LECs)
    2. 抗体：FOXC2 （大鼠抗人/小鼠，由Dr.N.Miura赠送，Miura et al, 1997, Genomics）
    VE-cadherin (山羊抗人/小鼠，R&D（#AF1002））
    Ki67 (兔抗人/小鼠，Abcam（#ab15580）
    二抗 （Alexa 488-conjugated，Alexa 555-conjugate，Alexa 647-conjugated， Life Technologies）
    1. 培养耗材：ibidi单通道载玻片μ-Slide I0.8 Luer （ibidi，Germany，80196）
                 灌流管，15cm，1.6mm直径（ibidi，Germany，10962）
                 封口夹 
    1. 仪器设备：ibidi流体剪切力系统，含空气泵（ibidi，Germany，10905）和流体单元（ibidi，Germany，10903）
     
    • 实验方法
    在实验开始前一天，请将所有需要使用的试剂，培养基，通道载玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培养箱中放置过夜，排除由于温度差产生的微量气泡。
     
     
    按照下面流程铺细胞：
    1. 将LECs细胞悬液加入通道载玻片中，注意，将移液器头插入注液孔中再加入细胞悬液，可以轻微倾斜通道载玻片帮助细胞悬液充满整个通道（图一）。

    2.盖上注液孔盖，将通道载玻片放入细胞培养箱中培养半小时，等待细胞贴壁。细胞贴壁后，拿出通道载玻片，在每个注液孔中分别加入60μl培养基，注意，枪头要悬在孔上方滴入培养基（图二）

    3.将通道载玻片再放入二氧化碳培养箱进行培养24小时左右，等到细胞刚刚长满为单细胞层，即可开始实验。注意，要使用单层细胞进行剪切力实验，使每个细胞均受到均匀的剪切力。
    4.静置条件下细胞培养。在通道载玻片中静置培养的细胞可以作为流体剪切力条件下培养的细胞对照。待流体实验开始的同时，将静置细胞培养的对照组放入二氧化碳培养箱中进行2天的培养。注意，培养过程中每天都要更换培养基。 
    二、搭建流体系统
    1. 将灌流管按照说明放在置在流体单元上。在灌流管的储液管中加入12ml培养基。这时不需要连接通道载玻片。实验前需要去除整个灌流管中的气泡，存留在灌流系统的气泡会影响剪切力的大小，有时还会使灌流系统中的液体流动停滞。打开ibidi泵控制系统，在任务栏中找到“Remove air bubbles”，ibidi流体剪切力系统将自动运行下面任务，用于去除气泡。（表一）
    2.连接通道载玻片。去除气泡后，就可以将之前准备好的含贴壁细胞的通道载玻片与灌流管相连。将搭载灌流管的流体单元从流体剪切力系统中取下，放到超净台中。将通道载玻片的注液孔用培养基装至过满状态(）。之后就按照下面的流程图连接通道载玻片（图四）。

    图四：a）封口夹轻轻将灌流管的硅胶管夹住。b）将其中一个鲁尔接头从中间的链接管中拔出。c-j）按图示，将鲁尔接头与通道载玻片的注液孔相连，注意不能产生气泡，会有部分培养基溢出。k）连接好后，将封口夹移除，用无尘纸将溢出的培养基擦除。l）全部连接好后，用显微镜观测一下通道内的细胞状态。
     
    3）检查灌流系统是否密封、是否将灌流管插入了正确的阀门。将封口夹夹住其中一根硅胶管，如果两边的灌流储液管液面不会下降或者上升，那么，整个系统就是密封的，并且是正确安装的（图五）。
     

                      图五
     
    三）振荡剪切力刺激，免疫荧光染色
     
    1. 以4 dynes/cm2；0.25 Hz（每4秒变换一次方向）刺激LECs细胞，进行48小时的培养。静置对照是直接将铺有LECs的通道载玻片直接放在培养箱中培养48小时，每天换一次液。
    2. Ibidi通道载玻片具有非常出色的显微成像效果，可以直接在通道内对处理的细胞和对照细胞进行免疫荧光染色，并且成像。实验结束后，轻轻吸出培养基，PBS清洗。
    3. 每通道以200μl的4%的多聚甲醛固定10分钟，用PBS清洗。
    4. 每通道加入200μl的0.1% Triton® X-100通透3-5分钟，用PBS清洗。
    5. 每通道加入200μl的1%BSA封闭20分钟，用PBS清洗后，直接吸出所有液体。
    6. 在通道未干之前加入一抗，二抗，进行常规的免疫荧光操作。
    7. 加入封片液，镜检观测。
     
    三 实验结果
     
     

    在振荡剪切力的刺激下，研究人员检测了FOXC2和细胞增殖生物标记物Ki67的表达情况。从图上可见，在OSS的刺激下，FOXC2有非常显著的表达（粉色）而，代表细胞增殖的Ki67的表达则显著下降。与此同时针对VE-cadherin细胞联合的染色表明，在有OSS刺激的情况下，VE-cadherin细胞联合的面积明显增大（右图）。
     

     

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